Dalam sesi pengundian yang dijalankan Selasa, sejumlah 432 ahli Parlimen menolak perjanjian itu sementara hanya 202 menyokong.
Undian ini juga mencatat rekod tersendiri apabila ia menjadi undi bantahan paling tinggi bagi kerajaan yang masih memerintah.
Rayuan dibuat May dalam ucapan terakhirnya sebelum pengundian Brexit dilaksanakan gagal memenangi hati dan minda ahli Parlimen Britain untuk menyokong perjanjian itu.
"Tiada perjanjian bermakna tiada tempoh pelaksanaan. Perjanjian kita sewajarnya melindungi hak penduduk EU yang tinggal di United Kingdom (UK) dan sebaliknya, bagi memastikan mereka dapat meneruskan kehidupan seperti biasa.
"Tiada perjanjian bermakna kita tidak dapat melindungi hak-hak penduduk," kata May.
"Perjanjian ini memberi jaminan keselamatan paling kukuh dalam sejarah EU. Ini bagi memastikan pasukan keselamatan dapat terus bekerjasama. Tiada perjanjian bermakna tiada kerjasama ini," tambahnya.
Bagaimanapun, ucapan beliau beberapa kali terganggu kerana sorakan pembangkang hingga mengundang campur tangan Speaker Dewan, John Bercow.
"Keadaan dalam Dewan ini yang sangat bising dan semakin tidak terkawal mesti dihentikan. Suara perdana menteri mesti didengar," kata Bercow.
Apa yang berlaku jelas memberi satu tamparan kepada Perdana Menteri Theresa May.
Britain dijadual meninggalkan Kesatuan Eropah (EU) dalam tempoh 10 minggu lagi, iaitu pada 29 Mac, 2019.
Dengan perkembangan ini, pemimpin pembangkang Jeremy Corbyn mengemukakan usul undi tidak percaya terhadap kerajaan.
"Keputusan malam ini adalah kekalahan paling teruk untuk kerajaan dalam Dewan ini sejak 1920-an. Kekalahan ini disifatkan satu bencana. Selepas gagal berunding selama dua tahun, Dewan ini telah membuat keputusan mengenai rundingan perjanjian Brexit yang diusul May.
"Saya dengar apa yang diperkatakan perdana menteri, tetapi tindakan kerajaannya selama dua tahun lepas juga tidak boleh diabaikan. Beliau sekarang berusaha untuk cuba menghidupkan semula proses yang gagal itu setelah ia ditolak sepenuhnya oleh Parlimen bagi pihak rakyat negara ini.
"Kerajaan yang memerintah menunjukkan prinsip menangguhkan dan menafikan dan ia sudah sampai ke penghujungnya. May tidak boleh sepenuhnya percaya selepas kegagalan dua tahun, beliau masih mampu merundingkan satu perjanjian yang baik untuk rakyat negara ini," kata Corbyn.
Langkah ini akan membuka laluan kepada pilihan raya awal.
Usul itu dijadual dibahas pada Rabu.
Sekiranya usul undi tidak percaya itu mendapat sokongan mana-mana pihak yang berjaya mengumpul majoriti dalam tempoh 14 hari, pilihan raya akan diadakan.
